我校生命科學學院李根喜教授團隊近期在《Nucleic Acids Research》雜志上發表了題為“Hydrazone chemistry-mediated CRISPR/Cas12a system for bacterial analysis”（Nucleic Acids Research, gkac809,https://doi.org/10.1093/nar/gkac809）的原創性研究論文。

該研究工作通過采用腙化學和巧妙的核酸序列設計，利用互補堿基配對引起的鄰近效應加速整個激活鍊的形成，從而快速有效地激活CRISPR/Cas12a系統，并進而提出了一種簡單而靈敏的銅綠假單胞菌分析方法。

Cas12a是一種來自V-A型CRISPR系統的核酸内切酶，通過識别其靶位點，激活内源性核酸酶活性後，可以不加區分地切割單鍊DNA（ssDNA），已被用于核酸檢測。然而，該系統不适合區分非常相似的單鍊DNA序列；并且，相似單鍊DNA序列之間的幹擾可能會發生交叉反應，影響分析的靈敏度和特異性。由于CRISPR/Cas系統的可編程性依賴于導鍊RNA和核酸的相互作用，研究團隊設想可以在系統的啟動序列中引入腙化學，從而更靈活地激活CRISPR/Cas12a系統，不僅可以提高特異性，而且可以廣泛應用于不同靶标的分析。

為了将腙化學應用于CRISPR/Cas12a系統中，研究團隊巧妙地将激活鍊設計為發夾結構的兩個片段，并分别由酰肼和醛基兩個腙連接基團修飾。在堿基互補配對的作用下，含有酰肼基團的TS1更容易與修飾醛基基團的TS2鍊通過腙鍵反應形成完整的TS1/TS2鍊。激活的Cas12a/crRNA複合體的反式裂解活性導緻ssDNA-FAM的任意切割和熒光恢複（圖1）。腙化學的引入可以提高CRISPR/Cas12a系統的特異性，可以有效區分目标序列中的單堿基錯配。

圖1腙化學介導的CRISPR/Cas12a系統。

研究團隊将所構建的腙化學介導CRISPR/Cas12a系統進一步用于細菌分析，他們選取了具有物種間高度保守的區域和物種特異性的可變區域16S rRNA基因序列(16S rDNA)作為靶标，該序列也通常被用于各種細菌的鑒定。研究團隊精心設計16S rDNA探針互補序列，由于16S rDNA與探針的特異性結合，從而釋放Probe/TS1-NHNH₂雜交鍊中的TS1-NHNH₂，該鍊可以通過堿基互補配對與TS2-CHO雜交，其中TS1-NHNH₂修飾的酰肼基與TS2-CHO修飾的醛基之間的腙鍵加速TS1/TS2的形成，而形成的TS1/TS2可以激活CRISPR/Cas12a系統，對ssDNA-FAM進行切割，導緻熒光的恢複（圖2）。

圖2基于腙化學介導的CRISPR/Cas12a系統的細菌分析機理。

綜上所述，研究團隊構建了一個腙化學介導的CRISPR/Cas12a系統，并探索了其識别單堿基錯配的能力。在這一設計中，他們利用堿基互補配對産生的鄰近效應加速了腙鍵的形成。同時，由于其模塊化和獨特的結構性質，腙化學可以将分裂的激活鍊連接到整個激活鍊上，從而有效地激活CRISPR/Cas12a系統。在此基礎上，他們進一步開發了高靈敏度的細菌檢測平台，并應用于細菌檢測。該平台操作簡單，靈敏度高，檢出限低，特異性好，不僅可以應用于細菌中16S rDNA的檢測，而且可以借助适體或探針識别級聯反應直接檢測核酸靶點。同時，該平台還可以為其他非核酸靶标的間接檢測提供了穩定、經濟的檢測系統。因此，腙化學的引入拓寬了CRISPR/Cas12a系統的應用範圍。

上海大學為本文第一署名單位，博士研究生生安志同學為論文第一作者，李根喜教授和張娟教授為共同通訊作者。研究工作得到了國家自然科學基金以及上海市“浦江學者”專項計劃項目的資助。